Page 23 - 化学魔法师入门手册

上海大学附属中学校本课程 化学魔法师入门手册——创新实践篇

(六) 紫外可见分光光度计的实验案例

案例 1. 过氧化氢酶的活性测定——紫外吸收法
实验原理

H2O2 在 240nm 波长下有强烈吸收，过氧化氢酶能分解过氧化氢，使反应溶

液吸光度(A240)随反应时间而降低。根据测量吸光率的变化速度即可测出过氧化

氢酶的活性。

实验仪器
研钵，离心机，250mL 容量瓶，移液管（0.5mL、2mL 各 2 支），10mL 试管

3 支，恒温水浴，紫外分光光度计

实验试剂

0.2mol/L pH=7.8 磷酸缓冲液（内含 1%聚乙烯吡咯烷酮）；

0.1mol/L H2O2（用 0.1mol/L 高锰酸钾标定）。

实验步骤

1. 酶液提取：称取新鲜小麦叶片或其它植物组织 0.5g 置研钵中，加入 2～3mL 4℃

下预冷的 pH7.0 磷酸缓冲液和少量石英砂研磨成匀浆后，转入 25mL 容量瓶中，

并用缓冲液冲洗研钵数次，合并冲洗液，并定容到刻度。混合均匀将量瓶置 5℃

冰箱中静置 10min，取上部澄清液在 4000rpm 下离心 15min，上清液即为过氧化

氢酶粗提液。5℃下保存备用。
2. 酶活性测定

取10mL 试管3支，其中2支为样品测定管，1支为空白管，按表1顺序加入试剂。

表1 紫外吸收法测定 H2O2样品液配置表

管 号 S1 S2 S3 管 号 S0 S1 S2

蒸馏水
粗酶液(mL) 0.2 0.2 0.2 1.0 1.0 1.0
/mL

pH7.8磷酸
1.5 1.5 1.5
(mL)

将 S0号管在沸水浴煮1min 以杀死酶液，冷却。然后将所有试管在25℃预热

后,逐管加入0.3mL 0.1mol/L 的 H2O2，每加完一管立即计时，并迅速倒入石英比

色皿中，240nm 下测定吸光度，每隔1min 读数1次，共测4min，待3支管全部测

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